Le mécanisme d'imperméabilité siège au niveau de la membrane externe. Il ne concerne donc que les bactéries à Gram négatif. Certaines mutations du génome bactérien peuvent entraîner la modification de la structure de certaines porines, ce qui a pour conséquence un moins bon passage des antibiotiques à travers la membrane externe et ainsi une moindre pénétration de l'antibiotique dans la bactérie. Les bactéries à Gram négatif présentent une imperméabilité naturelle aux glycopeptides. L'imperméabilité est un mécanisme passif, non consommateur d'énergie pour la bactérie.